胚中心B細胞分化の制御 - Autoimmunology Research

胚中心（GC）は、抗原によって活性化されたB細胞クローンが拡大し、免疫グロブリン遺伝子の超変異と選択を受ける主要な場所である。

このプロセスの繰り返しが親和性の成熟をもたらし、細胞レベルでのダーウィン的進化を再現することになる。

B細胞の選択により、4つの異なる結果がもたらされる。

すなわち、さらなる増殖と進化、アポトーシス（非選択）、メモリーB細胞や形質細胞への分化を伴うGCからの流出である。

GCのTヘルパー細胞は、主要組織適合性複合体（MHC）：ペプチド抗原複合体の密度を感知することによって、B細胞選択を制御する中心的な役割を担っていることが示されている。

抗原は免疫複合体の形で濾胞樹状細胞上に供給される。

この免疫複合体上の抗体は、B細胞受容体のアクセスから抗原を遮蔽することにより、抗原のアクセス性を制御している。

免疫複合体上の抗体をGC由来の形質細胞の産生する抗体で置き換えると、抗原の利用可能性が徐々に低下する。

このような抗体のフィードバックは、環境の変化による選択の厳しさの緩やかな上昇により、より親和性の高い抗体への方向性の進化をもたらす状況になりうる。

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はじめに
Bリンパ球は、哺乳類の細胞の中で唯一、体細胞超変異を起こす特殊な細胞であり、この過程は細胞スケールでの進化につながるものである1。この過程では、すでに確率的に数十のB細胞受容体遺伝子セグメントがランダムに変異・再編成され、膨大な数の可能な特異性を持つB細胞のレパトアが作り出されている。この初期レパトアは骨髄で自己反応性を除去され、いくつかの自己反応性を含む広範囲なナイーブな再循環B細胞レパトアとなる2。この初期レパトアは、少なくとも弱い交差反応性のB細胞クローンのB細胞活性化を引き起こすことによって、外界からやってくるあらゆるチャレンジに対応できる必要がある。Tリンパ球がその機能を発揮するには、弱い相互作用で十分であるが3、B細胞は最終的に高親和性抗体を産生する必要がある。B細胞の初期活性化を誘導するためには、低親和性の相互作用で十分である4, 5。この低親和性B細胞は、B細胞濾胞に再還流することなく成長し6、濾胞外形質細胞の初期生成につながり、効率的なオプソニン化作用のある抗体を作り出す7, 8)。しかし、病原体や毒素を効率的に中和するためには、高い親和性を持つ抗体が必要である。様々な初期活性化B細胞クローンからB細胞受容体の親和性を高めることは可能である。そのためには、クローン拡大、B細胞受容体遺伝子の体細胞超変異9, 10、そしてその前駆体よりも親和性が高く、自己抗原と交差反応しないB細胞の選択2, 3が必要である。胚中心（GC）で見られる、突然変異と淘汰の繰り返しによる高親和性化は、細胞レベルでのダーウィン的進化にほかならない、と私たちは考えています。約30年前から、このようなプロセスがGCで起こっていることが明らかになり始めている11, 12, 13, 14。本総説では、GCにおけるB細胞活性化から親和性成熟に至る過程を、特にこの過程における抗体の役割に着目して概説する。

抗体反応の開始と初期濾胞外抗体の形成
抗原接触により活性化されたB細胞は、ケモカインやケモカイン様メディエーターに誘導されて、二次リンパ組織のいくつかの区画を通過する複雑な移動パターンを経る（6、15、16で総説あり）。抗原はアクセス可能な形態でなければならない。低分子抗原は濾胞に到達しやすいが、アジュバントがない遊離抗原はB細胞応答をよく誘導しない17, 18。抗体は抗原の取り込みと分布に重要な役割を果たす。免疫複合体は辺縁洞を経由して脾臓に到達し、辺縁帯マクロファージに速やかに吸収される。B細胞は補体受容体2（CR2）を介して免疫複合体と結合し、B細胞濾胞の中心部へシャトルする19, 20。リンパ節でも同様のプロセスが起こり、リンパを介して運ばれた抗原は、被殻下洞とB細胞濾胞の間のマクロファージに富む領域を経由して侵入し、非認知B細胞によっても運ばれる21。遊離抗原は、記憶B細胞応答をよりよく誘導するものと考えられている。多くのメモリーB細胞はスイッチドB細胞レセプターを発現している。IgGはB細胞受容体のシグナル伝達を促進するだけでなく、Tヘルパー細胞への抗原提示を促進するため22, 23、より良い形質細胞分化につながる可能性がある24。しかし、形質細胞の寿命が長いため、二次抗体反応の開始時には常に既存の抗体が周囲に存在する。この既存の抗体は、すぐに抗原を複合化することができるので、実は二次抗体反応において、抗原が完全に抗体や補体から解放されることはないのです。抗体と免疫複合体は、B細胞濾胞への抗原輸送を促進するため重要なだけでなく、コアレセプターのライゲーションを通じてメモリーおよびナイーブB細胞のB細胞活性化を促進することになる。補体受容体2 (CD21) は、抗原を輸送する役割を果たすだけでなく、CD19とCD81を介したB細胞受容体シグナル伝達を増強する25。二次反応では切り替えられた免疫グロブリン（Ig）が存在するため、状況はより複雑である。IgGはIgMに比べて補体の固定効率が低く、FcγRII (CD32) を介してB細胞に負のコスティミュレーションシグナルを提供する26。

抗原活性化されたナイーブB細胞15, 27および再活性化されたメモリーB細胞28は、濾胞とTゾーンの境界で、おそらくCCR7リガンド、CCL19、CCL21に対する感受性を高めることによって、プライミングされた同族Tリンパ球に出会う29。Tゾーンと濾胞の境界でBリンパ球とTリンパ球が相互作用すると、B細胞の増殖と分化が開始されます。

この相互作用から発生するエフェクター細胞は、初期の濾胞外形質芽細胞、すなわちTゾーンと赤壁の境界の濾胞間やリンパ節髄質に発生する形質芽細胞の巣である6, 7, 8, 15, 28, 30. あるいは、B細胞は濾胞に再び入り込み、そこでGCを形成することもある16。また、この初期のT-B相互作用の間に、免疫グロブリンのクラススイッチの組み換えが強く誘導される。我々は、B細胞が濾胞とTゾーンの境界でプライム化したT細胞と相互作用すると、免疫グロブリン重鎖転写物が強く発現し、Igクラススイッチの組み換えが誘導されることを証明した。これは、一次反応中のこの初期の濾胞外段階30と、二次B細胞活性化28の12-24時間後に見られる。この初期の濾胞外相互作用の間にTヘルパー細胞と交換されるシグナルには、インターロイキン（IL）-4 30があり、マウスではIgG1クラススイッチ組換えの古典的誘導因子である31。クラススイッチ組み換えを含むB細胞活性化はIL-4非存在下でも起こることから32、IL-13 33を含むTh2サイトカインだけがIgG1クラススイッチ組み換えを誘導する因子ではないことが示された。これらの結果は、後にB細胞受容体トランスジェニック細胞と抗原特異的T細胞の養子移入を用いた研究でも確認された。スイッチされたIgクラスの実際の発現を早期に検出することにより、クラススイッチングはGC形成前および濾胞外形質細胞巣が完全に発生する前の非常に早い時期に起こることが証明された34。我々は最近、TI-II反応を用いて、濾胞外B細胞の活性化が活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）の発現を誘導し、免疫グロブリンのスイッチ組み換えがB細胞活性化後の最初の数日間、ちょうどT細胞領域の縁に入り込んだ頃に起こることを明らかにした35。

濾胞外病巣に発生したプラズマブラストの一部はクラススイッチ組換えを起こし、AIDを発現するが、通常V領域の超変異や免疫グロブリンアフィニティー成熟の大きな誘導はない36。マイクロダイセクションやシークエンスによってV領域の変異を追跡した我々の研究では、初期の濾胞外形質細胞における変異の数は非常に少なかった37, 38。GCは同時に発達しているので、見つかったわずかな突然変異は、GCの近くにある初期の形質細胞の出力に由来するものであろうと結論づけた。また、自己免疫性MRL.FaslprマウスやSalmonella typhimurium感染マウスで濾胞外形質細胞に突然変異を検出した例もある39, 40. 自己免疫性MRL.Faslprマウスでは自己反応性形質細胞が産生されるが、S. typhimurium感染マウスでは親和性の成熟が検出された。この領域で系譜的に関連した変異B細胞受容体V領域配列が発現していることは、濾胞外部位で形質芽細胞の分化と親和性成熟が起こっていることを示唆しているのかも知れない。しかし、少なくともサルモネラ菌感染症では、濾胞の基底部にBcl6陽性のGC様構造が見られる40, 41。従って、正常な大きさに成長しないまま出力過多の頓挫したGCが、超変異細胞を持つ濾胞外形質細胞巣を種にして親和成熟した出力をしている可能性も考えられる。

最初のT細胞-B細胞相互作用の後に発生する形質芽細胞は、あらかじめプログラムされた回数の分裂を行うようである。異なる数の前駆細胞を用いた実験によると、形質芽細胞は5-6サイクル後に非増殖性の形質細胞に分化する37。形質細胞の反応の程度にもよるが、大多数の形質細胞はその後数日以内にアポトーシスによって死滅し、通常、限られた数の細胞が長期に渡って生き残る37。この限られた脾臓形質細胞のプールの寿命は、少なくとも中期的には、主に新しく形成された形質細胞（新しい濾胞外反応またはGCからの出力）による補充によって調節されているようである。このため、濾胞外病巣の形質細胞は時間とともにゆっくりと入れ替わり、より多くの形質細胞がGCに由来することになる37。骨髄における同様の観察から、形質細胞の生存を制御するニッチ仮説が生まれた。つまり、ある微小環境に存在する付属細胞の限られた大きさのニッチが、長期的に形質細胞の生存を支えているのである42。

GC B細胞になるためのB細胞の成熟
T細胞との最初の相互作用で活性化されたB細胞の一部は、分化して形質細胞を形成するのではなく、濾胞に再突入する。濾胞への再突入は、CCR7リガンド感受性の喪失とEbi2の優勢なシグナル伝達によって指示される43, 44. CXCR5とEbi2の指令による動きによって、B細胞は外側の濾胞から濾胞間領域へと移動する27, 45。これらの領域は、リンパ節では被殻下洞下のTゾーンの縁に、脾臓ではTゾーン-レッドパルプブリッジングチャンネルに位置している。
GCの発生に重要なシグナルは、これらの部位で交換される46。Ebi2発現の消失44, 47とS1P2の誘導48により、B細胞は濾胞中心部に集まり、そこでまず増殖芽球の病巣が形成される49。

B細胞とT細胞の初期の濾胞外同族体相互作用の間に交換されるIL-4は、GC B細胞分化の誘導に重要である 50。この時期に濾胞外CXCR5+ Bcl-6+ T濾胞ヘルパー（Tfh）細胞によって産生されるIL-21は、一方では形質細胞の分化を支持しながらも、B細胞上のIL-21Rを介してGC分化を支持し、Bcl-6の発現を誘導するという2つの役割を持つらしい 51, 52, 53, 54. このことは、IL-21が特定の方向に分化を促進する因子としてよりも、一般的なB細胞分化因子として働いていることを意味している54。

濾胞中心部に至ったB細胞は増殖し、数日のうちに暗色帯と明色帯を示すGCへと分化する49。これらの初期濾胞性B細胞は、濾胞外形質細胞と同様に、あらかじめプログラムされた数の細胞周期を経ている可能性がある。異なる数の前駆細胞を用いてGCの発達を試験し、反応の初期段階でGCの大きさに影響を与えることを示した実験はあまりない。BCRノックインマウスから、異なる数の4-ヒドロキシ-ニトロシル（NP）特異的B細胞を養子移入して実験が行われた55, 56。TI-II 抗原としては珍しく、人為的に多数の抗原特異的 B 細胞を用いたマウスの NP-Ficoll 免疫は、強い濾胞外形質芽細胞分化と短時間の GC 応答を誘発する。濾胞反応開始後24時間以内にGCを測定したところ、移植した抗原特異的B細胞数とGCの大きさに良い相関があり、濾胞外形質細胞プールの大きさとも相関していた56。しかし、他の抗原ではこのような相関は見られない。サルモネラ菌に対する反応では、濾胞に移動してBcl6を発現するBブラストが相当数誘導される40, 41。しかし、これらは濾胞の拡大を経ず、完全に分化したGCに至らない。これには少なくともTLR4を介したシグナルが何らかの役割を担っていることが示されている40。したがって、もしGCの分化を開始する一連の細胞分裂があらかじめプログラムされているとすれば、TLR4などのシグナルが濾胞性B細胞の増殖と分化を早期に中止させたり、早期の出力分化や死亡につながったりする可能性があると考えられます。

成熟した GC には、暗領域と明領域が存在する。暗領域は主に増殖細胞と、アポトーシスB細胞を含むいくつかの刺絡体マクロファージ57を含んでいる。初期の研究では、すでにGCの暗領域で有糸分裂が確認されている57。ヒト扁桃腺の大GCにおけるKi-67染色は、GC暗黒帯における激しい増殖を示す58。GC暗黒帯のB細胞は、中心芽細胞と呼ばれる59。濾胞樹状細胞（DC）の体により、B芽細胞間の間隔が広くなっているため、従来の組織学では明部も明るく見える。FDCは抗原を保持しているため、抗原依存的な選択がGC light zoneで起こることが提唱された14。明領域では増殖活性が低いため、ここのB細胞はセントロサイトと呼ばれる。Ki-67染色により、光線帯でもかなりの割合の細胞が細胞周期にあることがわかり、特に多くのTヘルパー細胞が存在する外光線帯58, 60では、その傾向が顕著である。明領域の外側のTヘルパー細胞のいくつかは、前形成されたCD40L 60を発現し、それらが中心細胞の活性化および選択において役割を持つ可能性があることを示している。ヌクレオチドアナログパルスチェイスラベルを用いた最近の研究では、B細胞の増殖は明領域で引き起こされ、増殖した細胞は急速に暗領域に移動することが明確に示された61, 62。また、レーザー誘起蛍光ラベルを用いてin situでこれを確認し、明領域のTヘルパー細胞からのシグナルによってこの現象が引き起こされることを説得力のある形で示しているものもある63。

このことは、移動がGCにおける主要なテーマであることを示している。明領域と暗領域は、明領域のFDCによって発現されるCXL13と、GCとTゾーンの境界でストローマ細胞によって発現されるCXCL12に対する感受性のバランスによって発達している64。この部分のストロマは、暗領域に長い突起を伸ばしており、CXCL12を産生する65。明領域で選択された中心細胞は、CXCR4の発現を上昇させ、CXCL12に向かって移動を増加させる64。

GCにおけるB細胞選択
GCは、VDJ重鎖および軽鎖遺伝子に特異的に向けられた超変異が活性化される場所である12, 66。このプロセスにおける重要な酵素はAIDであり、B芽細胞が最初のIgクラススイッチの組み換えを受けている初期の段階で既に活性化している。B細胞がBcl-6を発現し、GC表現型を完全に獲得すると、この酵素はさらに活性化される35。免疫グロブリン遺伝子の超変異は、B細胞受容体の親和性をランダムに改善または悪化させるはずであるから、少なくとも親細胞と同程度の親和性を持つB細胞を選択する効率的な選択過程が必要である。超変異は繰り返し開始される。突然変異、増殖、選択の反復過程は、親和性成熟過程の最後に見られるような複雑な突然変異パターンを発展させることができる唯一の効率的な方法である67。細胞レベルでの系図の発達を説明するのも、反復プロセスだけである。系図は、共通の突然変異を持つ突然変異Ig V領域配列のバリエーションにつながる枝が木の一番下に発達し、そこから、これらの突然変異を共有するが、追加の突然変異で異なる枝が伸びていく12, 13, 68。このような系図の展開は、激しい増殖による生殖、Ig V領域の超変異による変異、より親和性の高い変異体に対する自然選択が、ダーウィン進化論における生物全体のレベルで起こるのと同じプロセスを細胞レベルで駆動していることを示している。

B細胞の選択は、系図を形成することによってGC反応の出力を形成するだけでなく、免疫グロブリンの補体決定領域がフレームワーク領域よりも多くの、そして異なった変異を引き寄せるようになる。これらの変異パターンのいくつかは、DNA配列モチーフが変異機構によって優先的に標的とされる、実際の変異ホットスポットである。その大部分は選択の影響によるもので、補体決定領域では置換型突然変異が有利であり、フレームワーク領域では置換型突然変異に対する強い選択により、サイレント突然変異が好まれるようである68, 69, 70。

GCにおけるT-ヘルパー細胞の役割
GCにおける進化に関する初期の理論は、GCのB細胞の選択におけるFDCに保持された抗原の役割に焦点を当てていた11, 14。B細胞受容体と免疫複合体の形でここに保持されている抗原との相互作用は、自然選択シグナルを提供しうる明白な要因である。FDCネットワーク上の抗原が保持されている領域の周囲には、CD4陽性のT-ヘルパー細胞が共通して存在することから、T-ヘルパー細胞がGCの選択を制御する上で重要な役割を担っているという仮説が導き出された。初期の研究では、GCのT-helper細胞はIL-4やIL-10といったB細胞分化を制御すると思われるサイトカインを発現していることが示された71, 72, 73。そして、B細胞が結合した抗原は、アポトーシスによる死を避けるために、局所のT-ヘルパー細胞に提示されなければならないというメカニズムが、新しく出現した自己反応性B細胞の生存を防ぐ方法であることが理解された。そこで、B細胞とFDC上に保持された抗原との相互作用の後、抗原が取り込まれ、明領域の外側の局所Th細胞に提示されるという仮説が導かれた74, 75。実際、濾胞に浸潤するT細胞は、免疫抗原に特異的であることが示されている76。さらに、明領域の外側のT-ヘルパー細胞に予め形成されたCD40Lが存在することは、それらが局所B細胞と相互作用するように準備されていることを示している60。さらなる証拠は、T-非依存性GCの研究から得られた。NP-Ficoll免疫後3日間活発に発育するこれらのGCは、非常に限られた寿命しかない。T 依存性抗原によって誘導される GC と同様に、その B 細胞は Bcl6 をアップレギュレートし、AIDを発現し、Bcl-2 の発現を失い、アポトーシスに対して感受性が高い。これらのGCは、FDCに保持された抗原を多く含み、正の選択シグナルを与えることができるはずであるが、形成後3日以内に広範なアポトーシスを介してインボリュートされている。最も簡単な説明は、この段階では、最初の抗原刺激がもはやB細胞の生存を支えることができず、B細胞はT-ヘルパー細胞から生存シグナルを受け取ることが不可欠な段階へと分化している、というものである。

選択事象に関する情報を得るために、これらの AID 発現 GC の突然変異を追跡するさらなる実験を行ったところ、期待はずれの結果が得られました。1 つか 2 つの突然変異を持つ細胞の 20% を除けば（PCR ポリメラーゼのエラー率をかなり上回っています）、あまり見かけられませんでした。これは、T 依存性抗原に反応する同程度の発達段階にある B 細胞の 85% に見られる最大 6 個の突然変異と比較すると、非常に少ないものでした。

このことは、T-ヘルパー細胞からの適切なCD40刺激なしには、超変異機構は非常に非効率的にしか誘導されないか、あるいは、明領域のT-ヘルパー細胞からのシグナル不足が暗領域への再循環を妨げ、さらなる超変異のラウンドの蓄積を防いでいることを意味している38。TI-II抗原で誘導された濾過膜外形質細胞におけるこれらの実験での突然変異の頻度は、対応するGCと同じ低い割合であり、濾過膜外応答がいくつかの免疫グロブリン遺伝子突然変異と関連していることが確認されている40。T-II 抗原で誘導された抗体反応には、若干の親和性成熟があることが報告されている。このことは、GCのような再循環を伴わない濾胞外部位における限定的な超変異が、これらの部位におけるT細胞の助けが不十分であることに起因している可能性がある。

インシリコモデリングを用いて親和性成熟に作用する様々なメカニズムを検証した理論的研究では、T細胞の助けに対する競争が、親和性の高いB細胞を選択するメカニズムとして、最も効率的に迅速な親和性成熟を導くと予測された。これは、抗原77にアクセスするための個々のB細胞の競争よりも効率的でした。T細胞の助けを得るためのこのような競争がどのように働くかについてのメカニズムは、親和性の高いB細胞がFDCからより多くの抗原を取り込み、あるいはより効率的に処理して、その表面上のMHCII：ペプチドの濃度を高めて提示するというものである78。この仮説は、GC B細胞の抗原提示経路に同族抗原を強制的に侵入させることができるDEC205抗体コンジュゲートを用いた研究で最近検証されている。眼窩内観察およびパルスラベリング研究との組み合わせにより、遠心分離機とGC T細胞との同族間相互作用がB細胞を遠心分離機プールに戻すこと、さらに重要なことに、これがB細胞表面に存在する抗原の量と相関していることがわかった 63, 79.
この研究の結果、T細胞との相互作用の間に存在する抗原の量が、下流の増殖およびV領域の超変異の程度を方向づけることがわかった80。このことは、GCにおけるTヘルパー細胞は、GCのB細胞分化の重要な保護者であることを証明している79。暗領域への帰還を指示するT細胞によって産生されるシグナルの正確な性質は、まだ不明である。B細胞との同族間相互作用が誘導された後、GCのT細胞ではIL-4とIL-21がわずかに増加するが81、これらのサイトカインには多くの機能がある可能性がある。

セントロサイトの選択における抗体のフィードバックの役割
T細胞が抗原提示量に応じてセントロサイトの運命を決めるという役割は十分に検証され証明されているが、このモデルでは、ある種のB細胞が他の細胞よりも効率よく抗原を取り込み提示する理由を十分に説明することはできない。抗原はFDC上の免疫複合体の形で、主にGC明領域に提示されるが、それだけに限定されるわけではない。このように豊富に存在するため、基本的にすべてのGC細胞は、大量の抗原と直接接触して相互作用し、また抗原を取り込む必要がある82, 83 (図1および図2)。

GCの発生は、抗原を複合化しうる抗体を産生する濾胞外病巣の形質細胞の分化と一致する7, 8, 30。抗原はネイティブな形で免疫複合体としてFDC上に保持される。免疫複合体は、大きな抗原を濾胞中心へ運ぶのに必須である。リンパ節では、被殻下洞マクロファージが免疫複合体を取り込み、B細胞領域に運び、濾胞中心部のFDCに運ぶナイーブB細胞に中継している84。同様に、脾臓では、抗原は、縁辺部マクロファージと濾胞中心19の間をシャトルリングする縁辺部B細胞によって輸送される。どちらの輸送形態も、免疫複合体中の補体成分C3が、まずマクロファージ上の、次にB細胞上の、そしてFDC上の補体レセプターに結合することに依存している84, 85。マクロファージとB細胞は、異なる補体レセプターの発現により、同時にC3と結合することができる85。免疫複合体はB細胞からFDCへ、アクチン重合を伴う能動的なプロセスで移送される86。マウスやヒトでは、FDCはCR2のスプライスバリアントを発現している87, 88。これらは補体に対してより高い親和性を持つかどうかは不明である。

GCにおける効率的な進化は、より高い親和性へと選択が向けられる場合にのみ達成される。種の指向的進化や指向的選択は、通常、環境の指向的変化によって引き起こされる89。抗原が豊富に入手可能であることから、他の要因が抗原へのアクセスを制限し、また、抗原のアクセス性の方向性変化をもたらすのではないかと考えたのである。濾胞外病巣で早期に産生された抗体や、抗原免疫複合体のエピトープを遮蔽することにより、B細胞受容体が容易にアクセスできないようなバリアが形成されるかもしれない。さらに、もしGCが応答中の早い段階から形質細胞の産生を行い、これらの抗体がGC内部の免疫複合体中の既存の低親和性抗体と入れ替わるならば、B細胞が抗原と相互作用するための閾値が徐々に上昇することになるであろう。親和性閾値は、ある時点でGC内で利用可能なB細胞の親和性を表し、血漿細胞の親和性は時間とともに上昇すると考えられるので、抗原アクセスのための閾値がゆっくりと上昇し、長い時間をかけてGC内でゆっくりとした方向性の進化を支えることになると考えられる。

このような抗体のフィードバック機構が役割を果たしているかどうかを調べるために、我々は、NP-ニワトリγグロブリン（CGG）と抗NP IgMの免疫複合体をマウス90に注射する実験を行った。注入された抗体は、マウスが産生する抗体とは異なるアロタイプであり、注入抗体と内因性産生抗体の区別が可能であった。この実験では、他の人が見たように、すべての免疫複合体が卵胞中枢のFDCネットワーク上に速やかに輸送されることが示されましたが（図1）、これらの免疫複合体中の低親和性抗体は、すぐに内因性抗体に置き換わることも示されました（図1）。さらに、親和性の異なる抗体を用いた実験から、この置換過程は、抗体と抗原の特異的相互作用の親和性に依存する特異的な効果であることが明らかになった。低親和性抗体の置換は非常に効率的で、免疫後5日目にはFDCネットワーク上に抗体の沈着は検出されないが、高親和性抗体はこの間、容易に検出された（図2）。このような置換過程が、GC反応が進行しているときにも起こりうるかどうかを調べるために計画されたさらなる実験では、注入された可溶性IgMが進行中のGCに沈着しうることが示された。つまり、親和性の高い抗体は、内因性抗体をより効率的に置換し、より長い期間これを行うことができたが、親和性の低い抗体は、反応の初期にしかGCに沈着することができなかったのである。このプロセスが選択と親和性成熟に及ぼす影響を調べるための下流実験では、注入されたIgM 90との競争がより厳しくなるため、より多くのアポトーシス、より少ない出力、より高い親和性抗体の産生が示された。

IgMがどのようにしてGCに入り、免疫複合体中の既存の抗体と置き換わるかは不明である。抗体はエピトープと可逆的に結合し、抗原との結合解除と再結合の速度がこの相互作用の親和性を決定する。したがって、もし他の場所で産生された抗体がGCにアクセスすることができれば、FDCのそこにある免疫複合体の沈殿物と時間をかけて入れ替わり、浸透していくはずです。GC由来の形質細胞はGC周囲に非常に近い位置にあり、そこで分泌された免疫グロブリンは、単に拡散によってGCに侵入することもできるが、能動輸送プロセスも可能であろう。

上記の実験は、すべてIgM抗体を用いて行われた。IgGクラススイッチングが抗体のフィードバックにどのような役割を果たすかは明らかでない。同程度の活性のIgGを用いた実験では、FDC上への沈着効率が低かった（Y. Zhang、未発表）。これは、GCへの抗体のアクセスを制御する活性プロセスが存在することを示しているのかもしれない。

鶏卵リゾチーム（HEL）に高い親和性を持つB細胞とFDC上のフィコエリスリン（PE）と結合したHELとの相互作用が、イントラビタル顕微鏡とin vitro 93で研究されています。イントラビタルのビデオでは、これらのB細胞がFDCから大きな物質のクラスターを取り込み、その後B細胞が活性化される様子が示されており、PEと結合した低親和性の相互作用するアヒル卵リゾチームを使用すると、抗原捕捉が減少することが示された。B細胞受容体の個々の親和性に依存した相互作用が抗原の取り込みと活性化を決定するという抗体フィードバック仮説と、大きな抗原のクラスターの取り込みは両立するのでしょうか。抗原は、FDC膜93を一部剥がすことによっても、大きなクラスターとしてFDCから取り込むことが可能です。しかし、B細胞は十分なBCR分子が免疫複合体と接触できた場合にのみ、これを達成することができる。これはやはり、これらのBCR分子が競合する抗体よりも高い親和性を持っていることに依存している。

免疫複合体中の抗原との結合に成功した BCR の数が多ければ、BCR と抗原の相互作用が免疫複合体内の抗原と抗体の相互作用よりも高い親和性を持つために抗原のクラスターを除去するか、あるいは免疫複合体と CR2 の相互作用よりも高い親和性を持つために FDC から除去することが考えられます。CR2は適度な親和性で補体と結合する94。つまり、B細胞がFDC上のCR1/2レセプターから免疫複合体の塊を除去することは比較的容易であるはずだ。さらに、B細胞はドナー細胞から抗原を含む膜の一部を獲得することができるため、この相互作用を断ち切る必要さえないかもしれない93, 95。

FDCは、捕捉した免疫複合体を、貪食やライソゾーム抗原提示経路への移行を伴わない非処理形態で細胞外に保持する83。このFDC樹状突起の表面保持により、GC28の免疫複合体の組織染色で見られる典型的なレース模様が生じる（図2）。イコソームと呼ばれる膜で覆われたビーズ状の構造物の第2の貯蔵庫がある96。細胞外の免疫複合体と細胞内の免疫複合体は、活性プロセスによって継続的に交換され、抗原を外からFDCの内部へとリサイクルしている85, 86。かなりの割合の抗原がリサイクルされているが、3時間以内に60％の抗原がリサイクルされなくなる86。FDCは免疫複合体の形で無傷の抗原を何ヶ月も保持することができる 97, 98。第2の細胞内リザーバーの存在は、抗原が長期間保持される保護された生息域を意味し、おそらく持続的にB細胞を再活性化するために時折提示されるため、重要であると思われる。2つのリザーバーが存在することは、抗体反応90の際に高親和性抗体が低親和性抗体に置き換わったときに顕著になる。上述の抗体フィードバック実験では、抗NP IgMa-NP-CGG免疫複合体を免疫した後、レース模様の樹状免疫複合体沈着物が、より親和性の高い内因性IgMb抗体と速やかに置き換わることが示された。この置換が起こっている間、残ったIgMaのビーズ状の染色パターンが生じた（図2）。これらのビーズに含まれる免疫複合体は、アイコソームを表していると思われるが、実験が行われた8日間、高親和性抗体による置換からはるかによく守られていた。もしこの解釈が正しければ、アイコソームはB細胞や抗体による直接攻撃から保護された、より長期間の抗原沈着の貯蔵庫であることを意味することになる。このような第二の抗原リザーバーの機能について推測することができる。親和性が低く、スイッチングされない初期段階の抗体と複合化した抗原のリザーバーをある程度確保しておくことは、親和性が高くない後期段階のB細胞を刺激したり、レスキューするために重要なことかもしれない。また、アイコソームは抗原の長期保存場所であり、繰り返し刺激を与えるために抗原を蓄積し、長期記憶を維持することができると推測されている99。

GCからの出力を制御するシグナル
メモリーB細胞やプラズマ細胞の産生を制御するシグナルについては、まだ多くのことが分かっていない。形質細胞は高親和性であることが選択される。形質細胞が産生する抗体親和性と形質細胞で生じた変異をGCおよびメモリーB細胞と比較すると、骨髄形質細胞集団は平均的なGCまたはメモリーB細胞よりも反応の早い段階から優れた親和性成熟を示すことがわかった100, 101. これは、抗体のフィードバックに続いて、Tヘルパー細胞からの分化シグナルがGCからの形質細胞の出力を調節している可能性があることを意味する。したがって、よりストリンジェントな抗体フィードバックは、アポトーシスによる細胞死をより多くもたらす以外に、GC90から発生する形質細胞の量を制限することができることを示した。抗体フィードバックが厳格になると、B細胞が抗原を取り込む能力が低下するため、Tヘルパー細胞との相互作用の効率が低下するはずである。このことは、抗体のフィードバックが厳しくなると、Th2様サイトカイン存在下でT細胞との同族体相互作用が成功する典型的な指標であるIgG1生殖細胞転写物の減少につながる実験で確認された30。GCのT-ヘルパー細胞は、B細胞との相互作用の後、IL-4とIL-21を産生することが示されている81。IL-4は、Th2応答、Igクラススイッチングを支持する因子として知られており、GCの誘導に重要である 50。IL-21はB細胞の分化を促進し、Bcl-6の誘導と同様に形質細胞の分化をサポートすることができる54。IL-21は、濾胞外反応において形質細胞の分化を促進するので、GCのB細胞に対しても同じことをする有力な候補である52。初期のGCから生成された形質細胞に関する研究は、このプロセスにおけるIL-21の役割を支持している（Y. Zhang、投稿）。

かつて、GCはB細胞記憶の主要な生産者とみなされていた。しかし、現在では、記憶B細胞はT細胞との相互作用に由来し、GCやTfh細胞からのシグナルに厳密には依存しないことが明らかになってきている102。記憶B細胞はクラススイッチされることも、IgMを発現することもあり、クラススイッチされた記憶B細胞は、二次抗原チャレンジによりプラズマ細胞へ分化する傾向がある103。CD80とCD273というマーカーは、メモリーB細胞のサブセットとその分化の可能性をよりよく特徴づけるために用いられている104。初期のin vitroの研究では、ヒトGC B細胞は、刺激されたCD40L発現メモリーT細胞と共培養すると、速やかにメモリーB細胞の表現型を獲得することが示された105。一般的なTヘルパー細胞のシグナルとは別に、何がこれらの異なるメモリーB細胞集団を誘導しているのか、多くは分かっていない106。遠心分離機を分化させ、さらに親和性の高い成熟細胞、すなわち形質細胞やメモリーB細胞を作り出すシグナルの研究は、今後10年間は間違いなく大きな関心事となることだろう。

結論
GCにおけるB細胞の分化は、FDCへの抗原の付着に始まる様々な要因によって制御されている。FDCは、進行中のGC反応に由来する形質細胞によって生成される抗体のフィードバックによって、アクセス可能か否かが決まる（図3参照）。FDCは、抗原の付着のほかに、さらなるシグナルを中継することもある107。B細胞がFDCからどれだけ抗原を取り込み、どれだけ効率的にこの抗原を提示するかによって、GC明領域のTfh細胞は、さらなる増殖と突然変異のラウンドを導く、あるいはエフェクター細胞の出力につながる制御シグナルを生成する。どのシグナルが正確に代替運命を制御し、どの付属細胞がそれを提供するかは、まだ不明である。サイトカインや接触依存性シグナルは、感染症やワクチンに対する親和性成熟応答だけでなく、自己免疫や癌の発生にも重要であるこの分化過程への介入候補であることは明らかである。抗体のフィードバックが、免疫反応を操作するツールに貢献できるかどうかは未解決の問題である。私たちの実験では、中程度の親和性のIgM免疫複合体を免疫すると、親和性の成熟が促進されることが示されている（Y. Zhang、未発表）。しかし、これは微妙なバランスであり、抗体の正確な親和性に依存する。最後に、IgGとクラススイッチングがこのプロセスの調節に関与しているかどうかも、まだ不明である。